由于肿瘤细胞进化出逃避宿主免疫监视机制，抗肿瘤免疫治疗的效果仍不理 想 (PD- 1 抑制剂治疗肿瘤的总体应答率为 10%-90% ，对多数肿瘤适应症应答率 约为 30%左右) ，其疗效不理想的原因主要受限于肿瘤细胞表面 PDL1 的表达水 平、T 细胞浸润水平、MSI-微卫星稳定性等因素的影响，因此仍急需开发其他治 疗手段以改善免疫治疗的疗效。
溶瘤病毒作为新型的肿瘤治疗类药物具有可在肿瘤细胞中实现快速增殖复制，并裂解肿瘤细胞，释放肿瘤特异性抗原，释放的肿瘤抗原可激发机体自身的 抗肿瘤免疫反应等突出优势，已 日益受到科学家的关注。溶瘤病毒因其具有基因 可操控性、规模化、肿瘤选择性等生物学特征使得溶瘤病毒具备作为个性化疫苗 应当具备的条件：①通过病毒的溶瘤作用，可获得丰富的各种来自于个体自身的 肿瘤抗原，并且不受抗原亚细胞定位的局限性，而传统的疫苗则需要细胞膜蛋白 作为疫苗；②溶瘤病毒瘤内注射病毒可产生局部感染反应，募集大量免疫细胞； ③在溶瘤病毒中加载免疫增强因子 (GM-CSF 和 PD- 1 抗体基因等) ，可获得高 浓度局部免疫因子，增强抗肿瘤免疫反应；④通过对溶瘤病毒进行改造，病毒可 选择性在肿瘤中复制，从而特异性溶解肿瘤细胞，直接发挥肿瘤杀伤作用而不伤 害正常组织；⑤溶瘤病毒可以大规模生产，并且质量可控性和稳定性良好。目前 基于这一原理设计溶瘤病毒 T-VEC 获得美国 FDA 批准上市用于治疗恶性晚期黑 色素瘤，为基于溶瘤病毒的肿瘤个性化疫苗的临床应用带来了曙光。
本项目设计的溶瘤病毒 (rHSV-APD1) 是基于人 I 型单纯疱疹病毒通过将表 达人源 PD- 1 单链抗体基因替换两个病毒双拷贝关键基因， 同时以hTert 启动子 调控病毒立即早期基因的表达而获得的重组型溶瘤病毒。该重组型溶瘤病毒在 hTert 启动子调控下可选择性地在肿瘤细胞中实现感染和快速复制但在正常细胞 中复制较差， 同时由于病毒基因组加载了表达人源 PD- 1 单链抗体基因， 因此病 毒在肿瘤细胞中快速复制的同时会表达大量 PD- 1 单链抗体从而可进一步提高溶 瘤病毒肿瘤治疗效果。
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成果介绍
科技计划：
成果形式：新产品
合作方式：技术咨询、技术服务
参与活动：
第二届江苏产学研合作对接大会
专利情况：
未申请专利
成果简介
成果概况
由于肿瘤细胞进化出逃避宿主免疫监视机制，抗肿瘤免疫治疗的效果仍不理 想 (PD- 1 抑制剂治疗肿瘤的总体应答率为 10%-90% ，对多数肿瘤适应症应答率 约为 30%左右) ，其疗效不理想的原因主要受限于肿瘤细胞表面 PDL1 的表达水 平、T 细胞浸润水平、MSI-微卫星稳定性等因素的影响，因此仍急需开发其他治 疗手段以改善免疫治疗的疗效。
溶瘤病毒作为新型的肿瘤治疗类药物具有可在肿瘤细胞中实现快速增殖复制，并裂解肿瘤细胞，释放肿瘤特异性抗原，释放的肿瘤抗原可激发机体自身的 抗肿瘤免疫反应等突出优势，已 日益受到科学家的关注。溶瘤病毒因其具有基因 可操控性、规模化、肿瘤选择性等生物学特征使得溶瘤病毒具备作为个性化疫苗 应当具备的条件：①通过病毒的溶瘤作用，可获得丰富的各种来自于个体自身的 肿瘤抗原，并且不受抗原亚细胞定位的局限性，而传统的疫苗则需要细胞膜蛋白 作为疫苗；②溶瘤病毒瘤内注射病毒可产生局部感染反应，募集大量免疫细胞； ③在溶瘤病毒中加载免疫增强因子 (GM-CSF 和 PD- 1 抗体基因等) ，可获得高 浓度局部免疫因子，增强抗肿瘤免疫反应；④通过对溶瘤病毒进行改造，病毒可 选择性在肿瘤中复制，从而特异性溶解肿瘤细胞，直接发挥肿瘤杀伤作用而不伤 害正常组织；⑤溶瘤病毒可以大规模生产，并且质量可控性和稳定性良好。目前 基于这一原理设计溶瘤病毒 T-VEC 获得美国 FDA 批准上市用于治疗恶性晚期黑 色素瘤，为基于溶瘤病毒的肿瘤个性化疫苗的临床应用带来了曙光。
本项目设计的溶瘤病毒 (rHSV-APD1) 是基于人 I 型单纯疱疹病毒通过将表 达人源 PD- 1 单链抗体基因替换两个病毒双拷贝关键基因， 同时以hTert 启动子 调控病毒立即早期基因的表达而获得的重组型溶瘤病毒。该重组型溶瘤病毒在 hTert 启动子调控下可选择性地在肿瘤细胞中实现感染和快速复制但在正常细胞 中复制较差， 同时由于病毒基因组加载了表达人源 PD- 1 单链抗体基因， 因此病 毒在肿瘤细胞中快速复制的同时会表达大量 PD- 1 单链抗体从而可进一步提高溶 瘤病毒肿瘤治疗效果。
创新要点
1、本研究设计的重组人 I 型单纯疱疹病毒 rHSV-APD1 是受肿瘤特异性启动 子 (hTert 启动子) 调控的溶瘤病毒，且是在野生型 I 型单纯疱疹病毒 KOS 毒株基础上敲除了病毒致病基因，确保了病毒在异常增殖的肿瘤细胞内特异性快速复 制，而在正常的细胞中则不能复制，大大增强了溶瘤病毒载体的安全性。
2 、本研究将 PD- 1 抗体介导的免疫治疗与溶瘤病毒介导的溶瘤效应有效结 合起来，制备了一种可高效表达 PD- 1 单链抗体基因的溶瘤型重组人 I 型单纯疱 疹病毒 rHSV-APD1：在溶瘤病毒发挥溶瘤效应裂解肿瘤细胞的同时，大量表达 PD1 单链抗体，抑制T 细胞表面 PD- 1 与肿瘤细胞或抗原递呈细胞表面 PDL- 1 的 相互作用，进而激活 T 细胞免疫应答，发挥双重的抗肿瘤效果。相对于单纯的 免疫疗法或者病毒疗法增强了其对恶性肿瘤的疗效。
主要技术指标
其他说明
1. 本项目通过采用 CRISPR/Cas-9 基因编辑技术， 以人 I 型单纯疱疹病毒 (HSV- 1) 为病毒载体将表达人源 PD- 1 单链抗体的基因替换两个病毒双拷贝关 键基因， 同时以hTert 启动子调控病毒立即早期基因的表达而获得了加载人源 PD- 1 单链抗体基因的重组人 I 型单纯疱疹病毒型溶瘤病毒 (rHSV-APD1) 。
2. 本课题组通过对病毒感染、培养条件的细致摸索， 已建立了溶瘤病毒 rHSV-APD1 体外生产、病毒滴度测定及病毒纯化等技术平台
3. 本课题组建立了溶瘤病毒 rHSV-APD1 体内 (血象分析、生化分析、神经 毒性评估) 和体外 (在正常组织来源的正常细胞和肿瘤细胞中的复制与杀伤效果 评估) 安全性评估系统，并初步证实 rHSV-APD1 具有良好的安全性 (在评价的 剂量内对小鼠血象和生化指标无显著性影响、对小鼠无明显的神经毒性；体外对 正常细胞基本无杀伤，可显著性杀伤肿瘤细胞)
4. 本课题组建立了溶瘤病毒 rHSV-APD1 体内 (在免疫缺陷鼠和免疫健全鼠 模型上建立皮下移植瘤模型、原位肿瘤模型及原发性肿瘤模型) 和体外 (高通量 的肿瘤细胞杀伤效果评估系统) 溶瘤病毒疗效评估系统，结果显示 rHSV-APD1 具有显著的肿瘤治疗效果 (病毒感染复数为 1 时，体外对 10 余种组织来源的数 十种肿瘤细胞的杀伤率均大于 60%以上；3 针 1×107 pfu 病毒治疗可完全清除免 疫健全小鼠皮下移植的鼠肝癌、鼠肾癌、鼠淋巴瘤等，可显著抑制免疫缺陷鼠皮 下移植的人源乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、脑癌 等肿瘤的生长) 。
5. 本课题组建立了溶瘤病毒 rHSV-APD1 体内和体外肿瘤治疗机制研究平
台，结果显示溶瘤病毒 rHSV-APD1 在体外可以通过直接裂解肿瘤细胞和通过抑 制肿瘤细胞周期进程诱导肿瘤细胞凋亡等途径杀伤肿瘤细胞；瘤内注射溶瘤病毒 rHSV-APD1 时，一方面病毒可以直接裂解肿瘤细胞，释放的肿瘤抗原可以募集 大量的免疫细胞浸润进而诱导机体产生肿瘤特异性细胞免疫和体液免疫反应；另 一方面溶瘤病毒 rHSV-APD1 在肿瘤组织中快速复制时在肿瘤组织局部能产生大 量的 PD- 1 单链抗体可以显著的协同促进溶瘤病毒治疗肿瘤的效果。
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